色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。

　　影響色譜柱使用壽命的主要因素

　　流動相因素

　　1.流動相pH

　　不同基質的填料具有不同的pH適用范圍。常溫下無定形硅膠在純水中的溶解度約為100mg·L-1，且在pH 1～9的范圍內溶解的硅膠量幾乎是常量，考慮到溶解速度的影響,對于硅膠基質的填料,其所能承受的流動相pH范圍約為1～8。鍵合相硅膠填料則由于鍵合層的屏蔽作用,使填料對流動相的適應范圍大大增加，如現在廣泛使用的反相色譜填料C18 (十八烷基硅烷鍵合硅膠)，其pH適用范圍可達2～10。當流動相pH值超出酸性范圍時，鍵合相易發生水解而流失;當流動相pH超出堿性范圍時，會加速硅膠的溶解而釋放出絮狀物堵塞柱子，這兩種反應均是不可逆反應，特別是在溫度較高(>40℃)的環境下，會使柱效迅速降低而報廢。

　　2.流動相變質

　　當前使用為廣泛的是硅基鍵合相填料，當以水溶液作為流動相或流動相中含有一定濃度的磷酸鹽緩沖液時，水溶液中或緩沖鹽溶液中會滋生出一些細菌或霉菌，從而堵塞固定相顆粒間的空隙。特別是對于多元自動比例混合的液相色譜儀來說,水相或緩沖鹽相獨立存貯，因存放時間較長而容易發生此類問題。

　　3.流動相純度

　　目前，廣泛使用的填料顆粒粒徑范圍在3～10μm,孔徑在6～10nm,色譜柱在使用中會有大量的流動相通過,如流動相含有微量不溶性雜質顆粒,則很容易在柱頭部位被截留,久而久之,造成色譜柱機械性堵塞,引起柱壓升高而無法正常使用。

　　4.其它因素

　　如，流動相的極性對柱子也有一定影響，甲醇、水、冰醋酸等極性較大的物質會破壞硅膠填料柱，正丁醇、二氯甲烷等極性小的物質會破壞化學鍵合硅膠柱，堿性溶液會破壞陽離子交換樹脂色譜柱,酸性溶液容易損壞陰離子交換樹脂柱。

　　二.樣品因素

　　1.樣品的溶解性

　　樣品試樣在配制中，如有少量微粒未能*溶解，則會隨試樣一起進入色譜柱，同樣，會沉積在柱頭處，造成色譜柱的堵塞。

　　2.樣品的純度

　　樣品中可能含有待分析組分以外的各種組分或雜質，這些組分或雜質可能會在柱內產生不可逆吸附，從而，使固定相的活性點被覆蓋，保留特性發生變化。

　　3.樣品的化學性質

　　待測試樣中的各種組分與填料之間應具有化學穩定性，比較典型的是在使用氨基鍵合柱時，應避免使用含羰基的化合物和流動相，如，丙酮、乙酸乙酯等，以免固定相中的NH2和酐、酮發發希夫(Schiff)縮合而使固定相破壞。

　　三.其它因素

　　影響色譜柱壽命的因素很多，除流動相和樣品因素外，還有其它一些外在因素，如，柱壓的影響，溫度的影響，色譜柱的正確沖洗，色譜柱的正確安裝等。

　　八大注意事項

　　1.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此，在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩。

　　2.應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然。

　　3.一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。

　　4.選擇使用適宜的流動相(尤其是pH)，以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。

　　5.經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右。

　　(下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或lv仿)依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么可以省略后用水沖洗這一步。si氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗脫能除去蛋白質污染。陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷(除去吸附在固定相表面的有機物)、甲醇、水依次沖洗。)

　　6.保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。

　　7.色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗;另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。在后兩種情況發生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1～2mm高度(注意把被污染填料取凈)再把柱內填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相(與柱內相同)填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱(5～30mm)，可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質的填料，只能在pH=2～9范圍內使用。柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強的物質保留于柱頂，特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂的填料上。

　　8.新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復。每次工作完后，應該用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如，ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素(氟、氯、溴)的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經常使用，應每隔4～5天開機沖洗15分鐘。

　　液相色譜柱的正確使用

　　1.加裝保護柱

　　保護柱的作用是過濾掉來自流動相和樣品的化學“拉圾”同時也可以有效除去流動相和樣品中的不溶物。盡管現在的色譜儀在流動相吸入口、進樣閥后部以及在色譜柱的兩端都裝有1、2μm等不同孔徑的濾器,但濾器只能除去不溶性顆粒而不能除去化學污然,因此,加裝保護柱是必要的,特別是在分析中藥、中成藥等復雜混合物和生物樣品時更是保護分析柱*的措施。保護柱填料應與分析柱一致,粒徑可較分析柱大。保護柱屬消耗品,經過一定次數的樣品分析(50～100次)后,出現柱壓顯著升高或峰形變壞或基線漂移時,應考慮更換保護柱。

　　2.過濾流動相和樣品

　　流動相通常由水或緩沖溶液與有機溶劑混合而成,原則上,所有經過色譜柱的流動相均應過濾,但在實際操作上應視具體情況而有所區別:當有機溶劑用色譜純級,水用石英亞沸水或其它超純水時,在能確保水和有機溶劑的質量且沒有受到污染時,過濾并無更多實際意義。當流動相中含有緩沖鹽時,則過濾是必要的,如前所述,當緩沖溶液放置一段時間(視環境溫度不同而異,夏季一般不超過48 h,冬季一般不超過一周)后,在使用前還應重新過濾。

　　所配制的樣品試液在注入流路系統前均要經0. 45μm(0.22μm則更好)孔徑濾膜過濾。要注意區分水系和油系,二者不可混用,以防止濾膜溶解而造成污染。裝流動相的容器和色譜系統中的在線濾器要定期清洗和更換,以避免濾器因過載而起不到過濾作用。

　　3.凈化樣品

　　當樣品中含有對色譜柱有損害的化學成分,如產生yong久性吸附的蛋白質、糖等有機分子和強吸附性物質,以及可能對柱填料產生破壞作用的基團離子。在進樣前應盡可能對樣品進行分離提純以除去多余雜質組分。

　　4.避免過高的柱壓

　　雖然液相色譜柱能耐受的壓力可達6000psi(磅/平方英寸) ,但過高及過大的壓力變化均會縮短色譜柱的壽命,避免的方法是

　　(1) 柱壓過高時,盡可能采用較小的流速,以不超過柱大允許壓力的一半為宜。

　　(2) 當流速較大時,應采取流速梯度的辦法使流速分步到位。

　　(3)使用手動進樣閥時,進樣閥的切換要盡可能的快。否則超過20%的壓力沖擊會很快使柱報廢。當使用多柱聯用時,柱切換要避免在高壓下進行。

　　5.注意溫度和酸堿度

　　一般以硅膠為基質的色譜柱高使用溫度不超過60℃，以低于40℃為宜，特別是在流動相pH接近使用限度時，更應降低使用溫度。溫度過高會加快鍵合相的水解和硅膠的溶解，從而，使填料性質改變，柱床塌陷，降低柱效，改變峰形。目前的鍵合硅膠色譜柱標示的pH適用范圍可達2～10,但在實際使用時應避免的pH條件,特別是在偏堿性的條件(pH≥8)下使用,如必須要在的pH條件下使用時,可通過以下方法避免柱損害:

　　(1)在泵和進樣閥之間加裝預柱(飽和柱)來飽和流動相;

　　(2)降低使用溫度;

　　(3)檢驗完畢后立即用與所使用的流動相互相混溶的“溫和溶劑”*清洗;

　　6.正確及時的沖洗

　　開始試驗前,應了解柱中當前是何種溶劑。對于新色譜柱,如無特殊說明均為評價報告中所用流動相。柱中當前溶劑一定要與分析樣品所用流動相互溶,如不能混溶,要用與二者均能相互混溶的第三種溶劑過渡。異丙醇是僅有能與各種溶劑混溶的試劑,可作為中介流動相使用。反相鍵合硅膠柱適宜的保存環境是純甲醇,如分析用流動相為緩沖液2有機溶劑,可先用較低甲醇含量(<20%)的甲醇2水置換掉原來的純甲醇,再進分析用流動相，以防止在柱內發生鹽的沉淀;試驗結束后,要及時用適當的溶劑沖洗系統并終過渡到純甲醇沖洗,對于含有緩沖鹽的流動相，的辦法是先用與分析用流動相組成*相同但不含緩沖鹽的溶液進行沖洗，再逐步過渡到純甲醇沖洗。多數報道沖洗液體積大約為柱容積的15～20倍,但終要以基線是否平直、壓力是否穩定決定。有些廠家的色譜柱標明了流動相中有機相的低使用濃度為≥5% ,使用時應給予注意。