1.熱變性及酸堿變性沉淀法 用于選擇性的除去某些不耐熱及在一定PH值下易變性的雜蛋白。

　　2.有機溶劑沉淀法 多用于生物小分子、多糖及核酸產品的分離純化，有時也用于蛋白質沉淀。

　　3.等電點沉淀法 用于氨基酸、蛋白質及其它兩性物質的沉淀。但此法單獨應用較少，多與其它方法結合使用。

　　4.非離子多聚體沉淀法 用于分離生物大分子。

　　5.生成鹽復合物沉淀 用于多種化合物，特別是小分子物質的沉淀。

　　6.鹽析法 多用于各種蛋白質和酶的分離純化。

　　鹽析法

　　一般來說，所有固體溶質都可以在溶液中加入中性鹽而沉淀析出，這一過程叫鹽析。在生化制備中,許多物質都可以用鹽析法進行沉淀分離，如蛋白質、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白質沉淀zui為常見，特別是在粗提階段。

　　鹽析法分為兩類，*類叫Ks分段鹽析法，在一定PH和溫度下通過改變離子強度實現，用于早期的粗提液;第二種叫b分段鹽析法，在一定離子強度下通過改變PH和溫度來實現，用于后期進一步分離純化和結晶。

　　一.影響鹽析的若干因素

　　1.蛋白質濃度

　　高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，但許多蛋白質的b 和Ks常數十分接近，若蛋白濃度過高，會發(fā)生嚴重的共沉淀作用;在低濃度蛋白質溶液中鹽析，所用的鹽量較多，而共沉淀作用比較少，因此需要在兩者之間進行適當選擇。用于分步分離提純時，寧可選擇稀一些的蛋白質溶液，多加一點中性鹽，使共沉淀作用減至zui低限度。一般認為2.5%-3.0%的蛋白質濃度比較適中。

　　2.離子強度和類型

　　一般說來，離子強度越大，蛋白質的溶解度越低。在進行分離的時候，一般從低離子強度到高離子強度順次進行。每一組分被鹽析出來后，經過過濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質組分鹽析出來。

　　離子種類對蛋白質溶解度也有一定影響，離子半徑小而很高電荷的離子在鹽析方面影響較強，離子半徑大而低電荷的離子的影響較弱，下面為幾種鹽的鹽析能力的排列次序：磷酸鉀>*>磷酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂。

　　3.PH值

　　一般來說，蛋白質所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越少溶解度越小，在等電點時蛋白質溶解度zui小。為提高鹽析效率，多將溶液PH值調到目的蛋白的等電點處。 但必須注意在水中或稀鹽液中的蛋白質等電點與高鹽濃度下所測的結果是不同的，需根據實際情況調整溶液PH值，以達到的鹽析效果。

　　4.溫度

　　在低離子強度或純水中，蛋白質溶解度在一定范圍內隨溫度增加而增加。但在高濃度下，蛋白質、酶和多肽類物質的溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下，蛋白質對鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下進行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進行。

　　二.硫酸銨的使用

　　硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對蛋白質巰基有敏感作用，使用前必須用H2S處理：將硫酸銨配成濃溶液，通入H2S飽和，放置過夜，用濾紙除去重金屬離子，濃縮結晶，100℃烘干后使用。另外，高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性(PH=5.0左右)，使用前也需要用氨水或硫酸調節(jié)至所需PH。

　　硫酸銨的加入有以下幾種方法：1)加入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況;2)加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況;3)透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進行透析，透析袋內硫酸銨飽和度逐漸提高，達到設定濃度后，目的蛋白析出，停止透析。該法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但手續(xù)煩瑣，需不斷測量飽和度，故多用于結晶，其它情況少見。

　　使用固體硫酸銨時：1)必須注意飽和度表中規(guī)定的溫度，一般有0℃或室溫兩種，加入固體鹽后體積的變化已考慮在表中;2)分段鹽析中，應考慮每次分段后蛋白質濃度的變化。一種蛋白質如經二次透析，一般來說，*次鹽析分離范圍(飽和度范圍)比較寬，第二次分離范圍較窄。3)鹽析后一般放置半小時至一小時，待沉淀*后才過濾或離心。過濾多用于高濃度硫酸銨溶液，因為此種情況下，硫酸銨密度較大，若用離心法需要較高離心速度和長時間的離心操作，耗時耗能。離心多用于低濃度硫酸銨溶液。

　　有機溶劑沉淀法

　　有機溶劑的沉淀機理是降低水的介電常數，導致具有表面水層的生物大分子脫水，相互聚集，zui后析出。該法優(yōu)點在于：1)分辨能力比鹽析法高，即蛋白質或其它溶劑只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀;2)沉淀不用脫鹽，過濾較為容易;3)在生化制備中應用比鹽析法廣泛。其缺點是對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作要求在低溫下進行。總體來說，蛋白質和酶的有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。

　　有機溶劑的選擇首先是能和水混溶，使用較多的有機溶劑是乙醇、甲醇、丙酮，還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。

　　有多種因素影響有機溶劑的沉淀效果：1)溫度 低溫可保持生物大分子活性，同時降低其溶解度，提高提取效率;2)樣品濃度和PH 與鹽析法中的作用基本相同;3)金屬離子一些多價陽離子如Zn2+和Ca2+在一定PH下能與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質形成復合物，這種復合物在水中或有機溶劑中的溶解度都大大下降，而且不影響蛋白質的生物活性。4)離子強度 鹽濃度太大或太低都對分離有不利影響，對蛋白質和多糖而言鹽濃度不超過5%比較合適，使用的乙醇量不超過二倍體積為宜。

　　其他沉淀法

　　一.等電點沉淀法

　　兩性電解質分子上的凈電荷為零時溶解度zui低，不同的兩性電解質具有不同的等電點，以此為基礎可進行分離。如工業(yè)上生產胰島素時，在粗提液中先調PH8.0去除堿性蛋白質，再調PH3.0去除酸性蛋白質。

　　利用等電點除雜蛋白時必須了解制備物對酸堿的穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險。 不少蛋白質與金屬離子結合后，等電點會發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時，必須注意調整PH值。 等電點法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯(lián)合使用，以提高其沉淀能力。

　　二.生成鹽復合物沉淀法

　　1.金屬復合鹽法

　　許多有機物質包括蛋白在內，在堿性溶液中帶負電荷，能與金屬離子形成沉淀。根據有機物與它們之間的作用機制，可分為羧酸、胺及雜環(huán)等含氮化合物類，如銅鋅鎘;親羧酸疏含氮化合物類，如親硫氫基化合物類。蛋白質-金屬離子復合物的重要性質是它們的溶解度對溶液的介電常數非常敏感，調整水溶液的介電常數(如加入有機溶劑)，即可沉淀多種蛋白。

　　2. 有機鹽法

　　含氮有機酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能與有機分子的堿性功能團形成復合物而沉淀析出。但此法常發(fā)生不可逆的沉淀反應，故用于制備蛋白質時，需采用較溫和的條件，有時還需加入一定的穩(wěn)定劑。

　　3.無機復合鹽法

　　如磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等。

　　以上鹽類復合物都具有很低的溶解度，極易沉淀析出。若沉淀為金屬復合鹽，可通以H2S使金屬變成硫化物而除去，若為有機酸鹽或磷鎢酸鹽，則加入無機酸并用C4H10O萃取，把有機酸和磷鎢酸等移入C4H10O中除去，或用離子交換法除去。值得注意的是此類方法常使蛋白質發(fā)生不可逆沉淀，應用時必須謹慎。

　　三. 選擇性變性沉淀

　　其原理是利用蛋白質、酶和核酸等生物大分子對某些物理或化學因素敏感性不同，有選擇地使之變性沉淀，以達到分離提純的目的。

　　此方法可分為：1)利用表面活性劑或有機溶劑引起變性;2)利用對熱的不穩(wěn)定性,加熱破壞某些組分，而保存另一些組分;3)酸堿變性。

　　四.非離子多聚物沉淀法

　　非離子多聚物是六十年代發(fā)展起來的一類重要沉淀劑，zui早用于提純免疫球蛋白、沉淀一些細菌和病毒，近年來逐漸廣泛應用于核酸和酶的分離提純。這類非離子多聚物包括不同分子量的聚乙二醇、NPEO、葡聚糖、右旋糖酐*等，其中應用zui多的是聚乙二醇。

　　用非離子多聚物沉淀生物大分子和微粒，一般有兩種方法：1)選用兩種水溶性非離子多聚物組成液液兩相體系，不等量分配，而造成分離。此方法基于不同生物分子表面結構不同，有不同分配系數。并外加離子強度、PH值和溫度等影響，從而擴大分離效果。2)選用一種水溶性非離子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。該方法操作時先離心除去大懸浮顆粒，調整溶液PH值和溫度至適度，然后加入中性鹽和多聚物至一定濃度，冷貯一段時間，即形成沉淀。